标题:新型双启动子表达质粒pCMVnir的构建及其促进基因免疫效果的研究
作者:卞继峰;于修平;耿昭;卢翌;穆玉兰;胡海燕;刘浩
作者机构:[卞继峰] 山东大学医学院分子生物学实验中心, 济南, 山东 250012, 中国.;[于修平] 山东大学医学院分子生物学实验中心, 济南, 山东 250012, 中国.;[耿昭] 山东大学 更多
来源:中华微生物学和免疫学杂志
出版年:2005
卷:25
期:8
页码:614-619
关键词:胞内寄生菌; 基因免疫; 启动子; 硝酸盐还原酶基因; 厌氧诱导启动子; 表达质粒; 免疫效果; 酶基因; BALB/c小鼠; 原核表达载体
摘要:目的 构建一种新型双启动子表达载体pCMVnir,研究其与胞内寄生菌联合应用促进基因免疫效果的作用。方法细菌硝酸盐还原酶基因B启动子nirB为厌氧诱导 启动子,根据nirB启动子的结构,设计合成改良的nirB,置换三启动子载体pTriEx-4中的T7Lac和P10启动子,而保留其CMVie启动子 ,获得携带CMVie和nirB双种启动子的新型载体pCMVnir,或称为pCN。构建pCN-EGFP和pCN-DsRed两种报告质粒,分别转化S .SL3261、E.coil DH-15a和CHO等细胞,检测报告基因的表达情况以确定两种启动子的活性。pCN-EGFP转化S.SL3261,接种BALB/c小鼠,定期解剖小 鼠收集黏膜相关淋巴组织,观察重组细菌和载体DNA在细胞中的定植及稳定性。免疫接种小鼠,并定期收集小鼠血清和阴道分泌物,以重组rEGFP为抗原,用 EEISA方法研究其增强免疫应答的能力。并构建人乳头瘤病毒L1E7双启动子pCN-16L1E7及对照单启动子载体pCMV-16L1E7和pNir -16L1E7,对比三者涛导黏膜免疫的差别。结果双启动子表达载体pCMVnir可在细菌和真核细胞中有效表达报告基因,在细菌中可形成肉眼可见的荧光 菌落和沉淀,转染CHO等真核细胞能够表达荧光蛋白,表明pC-MVnir载体的两种启动子都有活性,其中nirB活性是受兼性厌氧调控的。pCMVni r与细菌有较好的相容性,重组细菌可在动物体内有限复制和定植达6周,质粒可在细菌中稳定存在。以rEGFP为抗原检测发现pCN-EGFP诱导的免疫反 应高于常用的单启动子载体pCMV-EGFP。人乳头瘤病毒双启动子载体pCN-16L1E7诱导的免疫反应也高于其他单启动子载体。结论双启动子表达载 体pcMVnir与减毒胞内寄生菌匹配应用,能够提高抗原表达量及增强基因免疫反应的强度。并可作为一般基因克隆和表达载体,特别是作为原核表达载体,不 用添加诱导物,即可获得大量表达。
收录类别:CSCD
资源类型:期刊论文
原文链接:http://kns.cnki.net/kns/detail/detail.aspx?FileName=ZHWS200508002&DbName=CJFQ2005
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