标题:间充质源性种子细胞复合异体脱细胞软骨构建软骨组织的实验研究
导师:栾保华
作者:刘萌萌
论文完成年:2011
论文答辩日期:2011-05-12 00:00:00
学位名称:硕士
关键词:间充质;;干细胞;;诱导;;软骨;;种子细胞;;组织工程
摘要:目的 软骨缺损一直是临床工作的一大难题,自体软骨来源少,异体软骨吸收明显,均限制了同种软骨组织的应用,近年组织工程的研究发展为这一难题的解决带来了新的机遇,大量软骨组织工程的研究,带动了人工软骨时代的到来。本实验体外诱导外周血源性间充质干细胞获得软骨种子细胞,分离异体兔肋软骨获取脱细胞软骨,两者共同培养以构建新型软骨组织,为临床修复器官缺损及再造提供实验基础。 材料与方法 创建新西兰兔创伤模型,提取兔外周血间充质干细胞,体外行干细胞原代培养、传代、冻存、复苏及诱导分化成软骨。体外诱导培养生长良好的第三代间充质干细胞14d获得软骨种子细胞,显微镜下观察各期细胞生长特性及形态特征,制作种子细胞爬片行甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫细胞化学:联合中性去垢剂—酶法获得同种异体兔肋软骨脱细胞支架,制备石蜡切片行HE染色、甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫细胞化学,镜下观察染色结果;制备扫描电镜样本,扫描电镜下观察支架形态与结构。自体间充质源性软骨种子细胞与异体脱细胞软骨体外复合培养7d获得复合软骨,将复合软骨植入自体实验兔皮下,根据植入材料的差异分为A、B、C、D四组(A组:植入异体新鲜软骨B组:植入脱细胞软骨C组:植入复合软骨D组:体外培养复合软骨),植入材料于植入后6w、12w取出,制备石蜡切片行HE染色、甲苯胺蓝染色、MASSON染色,镜下观察染色结果;制备扫描电镜样本,扫描电镜下观察种子细胞与支架的生物相容性。 结果 1.细胞形态学改变外周血来源间充质干细胞培养3d-3.5d半量换液,可见少量细胞贴壁,呈短梭形或纺锤形,12-14d细胞已铺满皿底80-90%。1:2或1:3传代后细胞生长迅速,呈长梭形或多角形,5-6d即可铺满皿底80%-90%。复苏后第三代干细胞贴壁时间较冻存前延长,形态基本相同,呈长短梭形或多角形,5-7d即可传代。外周血来源间充质干细胞体外诱导培养7d,较对照组生长明显减慢,细胞团中央部分细胞呈类圆形或多角形,培养14d细胞增殖仍很缓慢,类圆形细胞逐渐增多。对照组细胞出现明显接触抑制。甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色显示:干细胞诱导14d,胞浆内有较多酸性黏多糖、软骨细胞特异性Ⅱ型胶原基质分泌。 2.脱细胞软骨支架观察兔脱细胞软骨呈乳白色,结构完整、孔隙均匀,组织学染色、扫描电镜观察显示起其仍保存大量酸性黏多糖及Ⅱ型胶原成分,其孔隙率为(61.31±8.45)%;孔径长度为(32.80±5.15)μm。组织学染色及扫描电镜观察均显示脱细胞软骨具有良好的三维立体孔径结构。 3.动物实验结果种子细胞与脱细胞软骨体外复合7d,初步获得复合软骨,扫描电镜示支架与种子细胞黏附良好,细胞伸出伪足贴附于支架表面,并伴有多量基质分泌。将各组实验材料植入兔背皮下后,6w、12w分别取出,各项观察结果示:B、C组材料与生物体具有良好的相容性,C组材料在生物体内可逐渐降解吸收,并可形成少量乳白色类软骨组织。 结论 1.兔外周血来源广泛,外周血间充质干细胞提取方便,体外生长良好,具有良好的自我更新能力与分化潜能,是良好的软骨组织工程种子细胞来源。第三代外周血间充质干细胞生长良好,适合行体外诱导培养成软骨细胞。 2.兔外周血间充质干细胞经体外适宜条件下冻存及复苏前后,其生物学活性未见明显差异。可利用该特性进行长期储存,为后期应用提供支持。 3.兔肋软骨经联合中性去垢剂-酶法脱细胞处理,仍具有良好的三维立体空间构架、良好的基质构成、良好的孔径长度及均匀的孔隙率,且与种子细胞具有良好的生物相容性,可作为理想的软骨组织工程支架材料。 4.自体间充质源性软骨种子细胞与同种异体脱细胞软骨体外复合培养可初步构建新型软骨组织,经动物体内埋植实验证实其具有良好的生物相容性和可降解性,是良好的组织工程复合支架材料,为临床修复器官缺损及再造提供了实验依据。
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