标题:大脑神经营养因子促进骨骼肌肌源性干细胞转化为神经样细胞的实验研究
导师:张风河
学号:200613111
作者:张雪
论文答辩日期:2009-05-26 00:00:00
关键词:骨骼肌肌源性性干细胞;体外培养;大脑神经营养因子; 组织工程; 神经样细胞
摘要:目的: 1.探讨骨骼肌源性干细胞体外分离纯化、培养、鉴定的方法,研究骨骼肌源性干细胞的生物学特性,为后续的实验奠定基础。 2.评估不同浓度的大脑神经营养因子(BDNF)在体外诱导骨骼肌肌源性干细胞后,肌源性干细胞分化为神经样细胞的能力;并鉴定分化后的神经样细胞,为以后的神经组织工程提供种子细胞。 方法: 1.采用Ⅺ型胶原酶和胰蛋白酶二步消化法获取大鼠骨骼肌肌源性干细胞, 微孔尼龙网纯化肌源性干细胞后进行体外原代和传代培养。观察细胞的形态,通过生长曲线、细胞融合率等指标研究骨骼肌源性干细胞的增殖与分化能力,利用免疫细胞化学染色和免疫荧光染色对所获得的细胞进行鉴定。 2.体外提取纯度较高的肌源性干细胞后,采用bFGF、EGF诱导肌源性干细胞成细胞球样细胞团,在贴壁的情况下,用不同浓度的大脑神经营养因子(BDNF)诱导分化,并检测GFAP的表达。 结果: 1.二步消化法适用于骨骼肌肌源性干细胞细胞的获取。通过不同直径的微孔尼龙过滤网(11um,20um,30um,41um)纯化骨骼肌肌源性干细胞。在生长培养基作用下,细胞增殖旺盛;在分化培养基条件下,细胞分化良好,可融合成肌管。Desmin和CD34免疫细胞化学染色呈阳性。 2.次代细胞在肌源性干细胞生长培养液中大部分贴壁生长,少数悬浮、成团。悬浮细胞生长较快,7~15 d出现神经球样细胞团,神经球转入预涂有多聚赖氨酸的24孔板后,加入不同浓度的BDNF,细胞逐渐贴壁生长,呈多种细胞形态:两极长的梭形细胞;有2~3个长突起的多角形细胞;突起多而短的多角形细胞;不规则形态细胞再作GFAP免疫组化染色,GFAP(+)。GFAP阳性率随BDNF浓度的升高而增加。 结论: 1.体外培养的骨骼肌肌源性干细胞具有良好的增殖与分化能力,微孔尼龙网过滤可纯化骨骼肌肌源性干细胞。控制血清的浓度,可调节细胞的增殖与分化,骨骼肌肌源性干细胞适用于组织工程和基因治疗。 2.BDNF作用于骨骼肌肌源性干细胞,可使细胞向神经样细胞方向分化;骨骼肌肌源性干细胞不仅为骨缺损修复、肌肉萎缩、心肌梗死、压力性尿失禁等的治疗带来新的曙光,还可用来移植治疗神经系统的疾病。
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