标题:CD133~+肿瘤干细胞在消化系肿瘤中的分离、鉴定及其生物学特性的研究
导师:韩双印
作者:胡珊珊
论文完成年:2011
论文答辩日期:2011-05-12 00:00:00
学位名称:硕士
关键词:CD133;;消化系肿瘤;;肿瘤干细胞;;靶向治疗
摘要:背景 肿瘤是全球范围内严重危害人类生命健康的重大疾病之一,世界上每年因罹患肿瘤而丧失生命的人约占总死亡人数的20%。随着科学家们对原发肿瘤的生长、浸润、转移和复发以及组织微环境等因素研究的逐步深入,肿瘤的诊断与治疗方法也取得了很大进展,目前已有的治疗手段包括手术、放疗和化疗等,但是这些治疗仍然存在治愈率低、药物副作用大、肿瘤转移与复发等诸多问题。近年来,越来越多的研究提示肿瘤的起源、发生、转移与复发的原因可能是肿瘤内存在极少量具有干细胞特性的细胞,即肿瘤干细胞(Tumor Stem Cells, TSCs)。 肿瘤干细胞有以下特点:第一、自我更新能力:将这些细胞在无血清培养基中培养,能够增殖形成与原代细胞相同的子代细胞;第二、多向分化潜能:将这些细胞在含血清培养基中进行培养,可分化成各种不同的肿瘤细胞,但是在特定的环境中这种分化潜能具有定向性;第三、高致瘤性:将极少量这些细胞接种于NOD/SCID小鼠体内即可形成肿瘤;第四、存在与干细胞相似的信号传导通路:Wnt、Shh、Notch、Bmi和HH-GLI等;第五、高迁徙和转移能力:肿瘤的转移在很大程度上是由于肿瘤干细胞的存在以及其通过各种途径进行的迁移造成的;第六、对射线和药物不敏感:肿瘤干细胞绝大多数处于静止期,而射线和药物以增殖期的肿瘤细胞为作用对象;第七、多药抗药性:研究表明肿瘤可以同时对多种药物产生耐药性,这与肿瘤干细胞表面存在的ABCG5蛋白有关,这种蛋白具有外排药物的作用,因此可以识别药物的共同抗原或者抗体部分,进而将吞噬入细胞的药物外排出细胞,即对多种药物产生耐药性。 CD133作为肿瘤干细胞的表面标志物最早是在脑肿瘤中发现的,Singh等从神经节胶质瘤、星形胶质母细胞瘤中成功地分离出CD133+肿瘤干细胞,并将其在体外无血清培养基中进行细胞培养,发现这种细胞能形成神经球样克隆,具有自我更新和分化能力,同时能在免疫缺陷小鼠体内形成肿瘤,肿瘤细胞的亚型与原位肿瘤一样,而且也能连续传代。另外,研究证明CD133+细胞在肝癌、胰腺癌、结肠癌、前列腺癌、乳腺癌、喉癌、胃癌、肾癌等多种实体瘤研究中发挥重要作用,CD133成为分离培养和鉴定肿瘤干细胞的特异性标志之一。近几年针对肿瘤干细胞的研究,更注重从其分子和基因水平等方面进行分析,结果表明CD133这种细胞表面粘附分子与其他细胞因子以及肿瘤微环境的形成,共同参与肿瘤的生长、转移、复发、细胞信号传导通路的调节以及放化疗抵抗的作用。因此,我们可以从阻断肿瘤干细胞的细胞周期、阻断信号传导通路的激活、改变放化疗作用靶点、干扰肿瘤干细胞微环境等方面开展针对肿瘤干细胞表面标志物CD133以及肿瘤相关途径的靶向治疗。 目的 1.探讨CD133+肿瘤干细胞在消化系肿瘤中的存在及生长情况; 2.探讨CD133+肿瘤干细胞的自我更新能力; 3.探讨CD133+肿瘤干细胞的分化能力; 4.探讨CD133+肿瘤干细胞的致瘤性; 5.探讨CD133与肿瘤分子靶向治疗的临床意义与研究前景。 材料与方法 1.标本来源: 河南省人民医院和郑州大学第一附属医院2010年05月-2010年11月肝胆外科和普外科的共15例肿瘤标本,其中胃癌5例、结肠癌5例、肝癌5例。 2.实验方法 2.1取手术切除的新鲜肿瘤组织,通过机械分离、胶原酶消化、滤网收集细胞,红细胞裂解液去除红细胞后,用RPMI1640无血清培养基(SFM)重悬为单细胞悬液。 2.2制备成2×107/m1细胞悬液,加入FcR阻断剂、PE-抗人CD133抗体,用流式细胞仪检测CD133+细胞的比例,并分选出CD133+和CD133-细胞。 2.3将分选所得的CD133+细胞、CD133-细胞和未分选细胞分别接种于RPMI1640无血清培养基(SFM)中,置于37℃、5%CO2培养箱中进行培养,每天观察细胞形态及CD133+细胞肿瘤球形成情况,并进行传代培养。 2.4将分选的CD133+细胞、CD133-细胞和未分选细胞分别接种于96孔板上,在第1、3、5、7、9、15天用MTT比色法测定各种细胞的增殖状态,以吸光度和生长天数分别为纵轴和横轴绘制生长曲线,并且通过曲线来比对这3组细胞的增殖速度。 2.5将分选的CD133+细胞接种于含10%胎牛血清的RPMI1640完全培养基(SSM)中,置37℃、5%CO2饱和温度的培养箱中培养,分别在培养的第1、4、8、12天用FCM动态检测CD133+细胞的百分比。 2.6取处于对数生长期的CD133+和CD133-细胞,制成细胞悬液,分别取500个、2×104个两种细胞注射于非肥胖型糖尿病/重症联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠腋窝及背部皮下,观察NOD/SCID小鼠肿瘤形成情况。 结果 1.流式细胞仪检测CDl33+细胞的表达: CD133+细胞阳性率为胃癌0.6%-1.0%,结肠癌1.9%-2.6%,肝癌0.8%-1.3%。 2.CD133+肿瘤细胞的体外培养: CD133+细胞在SFM中能够悬浮生长、增殖,随着培养天数增多,细胞逐渐聚集并形成悬浮的肿瘤细胞球,同时还能连续传代培养。 3.CD133+细胞体外增殖能力检测: CD133+细胞在SFM中有较强的体外扩增能力,曲线陡直,在1-3 d和5-7d更见显著;未分选细胞次之,生长曲线平缓;而CD133-细胞的曲线最为平坦,提示细胞体外增殖能力较弱。 4.CD133+细胞体外分化能力检测: CD133+细胞在SSM中能够分化形成贴壁生长的细胞,与原发肿瘤细胞相似,培养12天,CD133+细胞比例由92.01%下降至4.33%。 5.致瘤性观察: CD133+肿瘤细胞即使细胞数量少也有高致瘤性,500个CD133+肿瘤细胞就可以在非肥胖型糖尿病/重症联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠体内形成肿瘤,而CD133-细胞不能形成肿瘤。 结论 1.消化系肿瘤中存在CD133+细胞,但是数量较少; 2.CD133+细胞在无血清培养基中能生长形成肿瘤球,并能连续传代; 3.CD133+细胞在含血清培养基中逐渐分化成与原发肿瘤相似的细胞; 4.较少量CD133+细胞即具有高致瘤性; 5.CD133可能是消化系肿瘤干细胞表面标志物之一,利用CD133作为肿瘤治疗的分子靶向标志,可以为肿瘤分子靶向治疗提供途径。
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